رتبها

Western Blot
أخواني واخواتي في هذا الثريد رح اتكلم عن هذه (التقنيه/التجربة) من حيث التعريف، الأهميه واستخداماتها، تحضير العينه و خطوات التجربه و قراءه النتائج؟
من أكثر التجارب المحببه إلى قلبي، نبدأ على بركه الله...
@Biology1802
@Acad_Research
@dr2alshehri
#الدراسات_العليا

ماهي هذه التقنيه و لماذا نستخدمها/أهميتها؟
ويستيرن بلوت هي طريقة معملية تستخدم للكشف عن جزيئات بروتينية معينة من بين مزيج وعدد كبير من البروتينات. يمكن أن يشمل هذا الخليط/ المزيج من جميع البروتينات المرتبطة بنسيج (Tissue) أو نوع خلية معين(cell).

يمكن أيضًا استخدام هذه التقنيه لتقييم حجم البروتين protein size الذي هو محل اهتمامك ، او قياس كمية تعبير البروتين
level of protein expression

الخطوة الأولى في هذه التجربه هي تحضير عينة البروتينsample preperation. لا بد عينه البروتين تحضر بشكل سليم حتى تحصل على نتيجه صحيحه وواضحه. تحضير هذه العينه يعتمد على عدة عوامل منها: نوع الخليه/النسيج لااختيار المحلول المناسب لاإذابه البروتين، يتبع>>

ايضاً نوع البروتين هل هو بروتين معزول من جدار الخليه أو بروتين معزول من داخل الخليه أو بروتين يُفرز من الخليه/النسيج..وغيره من امثله على نوع البروتين. (معرفه مكان تواجد البروتين ووظيفته مهم لااختيار suitable reagents) وايضاً مهم جدا لتحديد كميه البروتين و تركيزه المناسبين..

ممكن كبدايه لك أن تبحث في Litreture review لتحصل عن معلومات بخصوص التركيز المناسب والكمية. وبالرغم من ذلك في بعض الأحيان لابد من القيام ببعض التحسينات والتعديلات optimization

ثم تأتي خطوه فصل البروتينات عن بعضها البعض مما يجعل البروتينات تتكشف في سلاسل وطبقات خطية ثم بشحنة سالبة وبهذه الخطوة يتم فصل جزيئات البروتين وفقًا لأحجامها باستخدام طريقة تسمى protein separation
بمعنى يتم فصل جزيئات البروتين وفقًا لأحجامها باستخدام ( تسمى الفصل الكهربائي) .

قبلها تكون خطوة تحضير الجل SDS-PAGE يحضر إما في نفس اليوم للاستخدام أو الافضل أن يحضر قبل بيوم أو يومين. اختيار حجم الجل يعتمد على نوع البروتين والماده المذابه فيه وعدد العينات والكمية المطلوبه من البروتين للحصول على النتيجه الصحيحه

بعد عمليه الفصل، يتم نقل البروتينات transfering step
من الجل إلى الغشاء blot
أختيارك ل blot يعتمد على عناصر محدده.
يحمل هذا الغشاء blot جميع شرائط و انواع البروتين الموجودة في الأصل على الجل. لذلك ، لابد من اخضاع هذا blot لعلاج يسمى الحجب blocking.

blocking
والذي يمنع حدوث أي تفاعلات غير محددة وغير مرغوبه nonspecific binding.
Blocking agents such as milk or BSA
انواع كثيره منها الحليب أو BSA
اختيار لأي منهما يعتمد على نوع الأجسام المضاده المستخدمه للكشف عن البروتين

الخطوه الاخيره هي Antibody staining أو probeing
.هي تحضين الغشاء بجسم مضاد يسمى الجسم المضاد الأولي primary antibody، والذي يرتبط على وجه التحديد بالبروتين الذي هو محل الاهتمام و البحث. بعد الحضانة وتختلف فترتها على حسب البوربوينت والجسم المضاد لكن بالعادة تكون ١٦ ساعه

ثم بعد ذلك washing step
يتم غسل أي جسم مضاد اولي
زائد لم يرتبط بالبروتين،ويتم تحضين
الغشاء مرة أخرى،ولكن هذه المرة بجسم مضاد ثانويsecondary antibody
يتعرف بشكل خاص على الجسم المضاد الأولي ويرتبط به وليس بالبروتين.هذا الجسم المضاد الثانوي يرتبط
بإنزيم ينتج عنه اما لون أو ضوء

هذا الجسم المضاد الثانوي يرتبط
بإنزيم ينتج عنه اما لونًا أو ضوءًا ، مما يسمح باكتشافه وتصويره بسهولة عن طريق جهاز خاص بهذه التقنيه.
جميع هذه الخطوات تسمح باكتشاف بروتين معين من بين مزيج من البروتينات.

بقي آخر نقطه حابه اتكلم عنها و هي قراءه النتيجه، كيف؟ ملخصه بشكل بسيط في هذه الصوره. و مثال للنتيجة من شغلي في صوره أخرى ايضاً