كيفية عزل الخلايا الليمفاوية التي يمكن استخدامها في عدة تجارب من عينة الدم
تسمى هذية الطريقة
PBMCs:
Peripheral Blood Mononuclear Cell
تسمى هذية الطريقة
PBMCs:
Peripheral Blood Mononuclear Cell
يمكن استخدام الطرد المركزي المتدرج الكثافة لعزل الخلايا أحادية النواة (الليمفاوية) من الدم من خلال استغلال الاختلافات في الكثافة بين الكريات البيضاء المختلفة ووسط تدرج الكثافة.
تتمتع الخلايا الحبيبية والكريات الحمراء بكثافة أعلى من الخلايا أحادية النواة وبالتالي تترسب من خلال الطبقة المتوسطة ذات الكثافة المتدرجة أثناء الطرد المركزي.
لعزل الخلايا أحادية النواة من الدم ودم الحبل السري ونخاع العظام ، يوصى باستخدام وسيط بكثافة 1.077 جم / مل ، مثل Lymphoprep ™ أو Ficoll-Paque ™.
مواد المطلوبة:1. عينة دم كاملة
2. جهاز طرد مركزي
3. وسط متدرج الكثافة (مثل Lymphoprep ، او Ficoll
4. محلول ملحي مخزون من فوسفات
5. مصل بقرى جنيني ( FBS ) و DMSO لتحضير frozen media
6.انابيب طرد مركزي
قبل أن تبدأ: تأكد من أن جميع الكواشف في درجة حرارة الغرفة (15-25 درجة مئوية)
2. جهاز طرد مركزي
3. وسط متدرج الكثافة (مثل Lymphoprep ، او Ficoll
4. محلول ملحي مخزون من فوسفات
5. مصل بقرى جنيني ( FBS ) و DMSO لتحضير frozen media
6.انابيب طرد مركزي
قبل أن تبدأ: تأكد من أن جميع الكواشف في درجة حرارة الغرفة (15-25 درجة مئوية)
1. قم بتخفيف عينة الدم ب PBS بنسبة 1:1
بمعنى كل 3 مل من عينة الدم تخفف ب 3 مل من المحلول PBS
2. ضع 3 مل من محلول عزل الخلايا الليمفاوية Ficoll (رج الانبوب قبل الاستخدام) في أنبوب جديد من انابيب الطرد المركزي ( أنبوب لكل عينة )
بمعنى كل 3 مل من عينة الدم تخفف ب 3 مل من المحلول PBS
2. ضع 3 مل من محلول عزل الخلايا الليمفاوية Ficoll (رج الانبوب قبل الاستخدام) في أنبوب جديد من انابيب الطرد المركزي ( أنبوب لكل عينة )
4. ابدأ بنقل الدم المخفف إلى الانبوب الذي يحتوي على الFicoll ببطئ كالتقطير حتى تبقى كريات الدم ب الطبقة العليا بدون أن تختلط مع محلول الفصل Ficoll
كرر الخطوات لكل عينة.
احرص على عدم خلط الطبقتين.
كرر الخطوات لكل عينة.
احرص على عدم خلط الطبقتين.
5. قوم بوضع الانابيب في جهاز الطرد المركزي على درجة حرارة 18_20 لمدة 30 دقيقة على قوة 400g
6. ستلاحظ بعد انتهاء الطرد المركزي أن كل أنبوب تم فصله إلى 4 طبقات
1.plasma
2. Monoclonal cells, lymphocytes
4. Fiocoll
5. Granulocytes, RBC
6. ستلاحظ بعد انتهاء الطرد المركزي أن كل أنبوب تم فصله إلى 4 طبقات
1.plasma
2. Monoclonal cells, lymphocytes
4. Fiocoll
5. Granulocytes, RBC
7. اسحب طبقة الخلايا الأحادية عن طريق إدخال الماصة مباشرة من خلال طبقة البلازما العليا إلى الخلايا أحادية النواة في الواجهة. بدلاً من ذلك ، يمكنك أولاً إزالة الطبقة العليا البلازما ثم تجميع الخلايا اللمفاوية في أنبوب جديد. ملاحظة: يمكنك الاحتفاظ بالبلازما.
اغسل الخلايا المحصودة مرتين بPBS. الخلايا اللمفاوية أصبحت مترسبة في قاع الانبوب وهي جاهزة الآن لتخزين في Frozen media
Frozen media : 90% FBS + 10% DMSO
اخلط 400_500 ميكرولتر من الميديا التي تم تحضريها مع الخلايا اللمفاوية وانلقيها في أنبوب التخزين.
والان لديك خلايا لمفاوية جاهزة لتجارب المخبرية..
اخلط 400_500 ميكرولتر من الميديا التي تم تحضريها مع الخلايا اللمفاوية وانلقيها في أنبوب التخزين.
والان لديك خلايا لمفاوية جاهزة لتجارب المخبرية..
جاري تحميل الاقتراحات...