سلسلة تغريدات تتحدث عن الـ PCR
بتطبيق عملي مع مقاطع فديوا من المختبر قمت بترجمتها عند كل خطوة بالتفصيل وستكون من عملية الاستخلاص Extraction حتى ظهور الباند في gel، وسيشمل الشرح ايضاً التعامل مع جهاز NanoDrop
سيكون العمل على عينة دم، والـ kit المستخدم هنا هو تابع لشركة Qiagen
بتطبيق عملي مع مقاطع فديوا من المختبر قمت بترجمتها عند كل خطوة بالتفصيل وستكون من عملية الاستخلاص Extraction حتى ظهور الباند في gel، وسيشمل الشرح ايضاً التعامل مع جهاز NanoDrop
سيكون العمل على عينة دم، والـ kit المستخدم هنا هو تابع لشركة Qiagen
سيكون اسم الـ kit المستخدم هو:
QIAamp® DNA Mini and Blood Mini
في هذا المقطع تم الحديث عن تجهيز الادوات قبل البدء في عملية الاستخلاص، وأهمية تعقيم الادوات والسطح، بالاضافة الى ضرورة تسمية العينات بحبر دائم حتى لايتم مسح الاسم بواسطة الكحول، مع ضرورة تحريك العينة قبل البدء
QIAamp® DNA Mini and Blood Mini
في هذا المقطع تم الحديث عن تجهيز الادوات قبل البدء في عملية الاستخلاص، وأهمية تعقيم الادوات والسطح، بالاضافة الى ضرورة تسمية العينات بحبر دائم حتى لايتم مسح الاسم بواسطة الكحول، مع ضرورة تحريك العينة قبل البدء
في هذا المقطع كان الحديث عن محلول Proteinase K وكمية الدم المأخوذة وطريقة تحريكهما بجهاز الـ Vortex مع وضعهما في جهاز الطرد المركزي لفترة قصير ة مع الحذر اثناء نقل العينة الى انابيب Spin column وكتابة اسم العينة بالشكل الصحيح من الاعلى ومن الجنب حتى يسهل الرجوع اليها
الان يتم وضع العينات مرة اخرى في جهاز الطرد المركزي ولكن بسرعة ٨٠٠٠ دورة لمدة دقيقة، ثم التخلص من انابيب التجميع، مع عدم رمي الفلتر، ثم اضف ٥٠٠ مايكروليتر من محلولAW1 buffer
ثم ضعه في جهاز الطرد المركزي، كرر الخطوة السابقة لكن مع محلول
AW2 bufferوبسرعة اعلى في جهاز الطرد المركزي
ثم ضعه في جهاز الطرد المركزي، كرر الخطوة السابقة لكن مع محلول
AW2 bufferوبسرعة اعلى في جهاز الطرد المركزي
في هذه المقطع سيتم نقل العينات الى انابيب ذات حجم ١.٥ ملل “eppendorf tube”، ثم اضافة ٢٠٠ مايكروليتر من محلول AE buffer وذلك لتنقية العينة، ولاننسى تغيير الـ Tip رأس الماصة حتى لايحدث التلوث بين العينات، مع تركهم لمدة دقيقة ووضعهم في جهاز الطرد المركزي قبل ذلك
الان انتهينا من عملية الاستخلاص وسنحتاج التأكد من تركيز ونقاوة الحمض النووي وسنستخدم لذلك جهاز Nanodrop وسنحتاج تقريبا ١.٥ مايكروليتر من العينة، وهنا لدينا عدة اشياء يجب الانتباه لها من ضمنها
260/230 وهنا يجب الرقم ان يكون بين ١.٥ الى ٣
260/230 وهنا يجب الرقم ان يكون بين ١.٥ الى ٣
الان ننتقل الى جهاز الـ PCR ولدينا عدة خيارات وا اكثر من Kits يمكن استخدامه لذلك، لكن بالمجمل يجب ان تحتوي العينة على التالي:
-العينة DNA
-برايمر primer 1
-برايمر primer 2
-dNTPs
-Taq DNA Polymerase
-Mgcl2
-PCR Buffer
-RNase-Free Water
-العينة DNA
-برايمر primer 1
-برايمر primer 2
-dNTPs
-Taq DNA Polymerase
-Mgcl2
-PCR Buffer
-RNase-Free Water
وهنا نعمل مايسمى كوكتيل او مستر مكس، لكل المحاليل السابقة عدى العينة طبعاً ( والبرايمر اذا كنت تستخدم اكثر من برايمر )، ومن ثم يتم تقسيمه على كل انبوب PCR Tube ومن ثم ضبط الجهاز
الان الخطوة الاخيرة وضع العينات في الـ gel وذلك بوضع ١٪ من الا قاروز مع اضافة TBE مع الاثيديوم برومايد، واثناء اضافة العينات نضيف loading Buffer اليها وتشغيل الجهاز على تيار كهربائي ١٠٠ فولت لمدة تترواح من ٢٠ الى ٣٠ دقيقة، وسنلاحظ في النهاية وجود باند واضح والآخر لا.
جاري تحميل الاقتراحات...