تحكم في خطأك! كيفية تقليل أخطاء المصاصات والحصول على SDs منخفضة في qRT-PCR
التباين في القراءات غالبًا ما يربك نتائجنا ويقودنا إلى التوتر و البحث عن حلول. هناك نوعان من التباين ، الأول هو التباين البيولوجي. يمثل هذا الطبيعة العشوائية للعينة التي تعمل بها والاختلافات المتأصلة بين العينات من نفس الظروف.لا يوجد الكثير الذي يمكن القيام به لتقليل من هذا النوع
النوع الثاني من التباين تقني ، وينبع من الاختلافات القائمة على التقنية بين كل عينة مكررة في تجربتك. يتضمن هذا النوع من الأخطاء اختلافات في كيفية تحليل العينات بواسطة أجهزتك والاختلافات الطفيفة في أداء الكواشف الخاصة بك.
بالنسبة إلى تفاعل البوليميراز المتسلسل الكمي (qRT-PCR) ، قد يكون هناك العديد من العوامل التي تؤثر على التكرارات التقنية بما في ذلك الاختلافات الطفيفة الناتجة عن plate variability ، أو freeze thaw cycles و غيرها التي تؤثر على حركية البوليميراز ، وكلها تساهم في التباين و الاختلاف
ومع ذلك ، فإن أكبر مساهم في التباين التقني هو أنت على الأرجح! أو بالأحرى أسلوبك في سحب العينات ، والذي قد يتسبب في احتواء كميات مختلفة قليلاً من القالب أو البوليميراز أو البادئات ، والتي قد تنعكس جميعها في بياناتك.
نظرًا لأن qRT-PCR هو تفاعل أسي ، حيث يتم تضخيم منطقة الاهتمام مع كل دورة ، يمكن أن يكون لتأثير الاختلافات الطفيفة في الكواشف تأثير تراكمي على قيمة Ct الخاصة بك. إذن ، ما هي الاستراتيجيات التي يمكن استخدامها لتقليل التباين التقني؟
المُختصين الجزيئين يقولون دائمًا: "كن مستعدًا"
إبتعد عن المشتتات الخاصة بك.
عملت ذات مرة مع باحث في مرحلة ما بعد الدكتوراة رفض السماح لطالبة في مرحلة الدراسات العليا بإجراء أي تجربة تتطلب الكثير من الماصات دون تناول الطعام أولاً .
إبتعد عن المشتتات الخاصة بك.
عملت ذات مرة مع باحث في مرحلة ما بعد الدكتوراة رفض السماح لطالبة في مرحلة الدراسات العليا بإجراء أي تجربة تتطلب الكثير من الماصات دون تناول الطعام أولاً .
إذا كنت (جائعًا + غاضبًا) فقد تؤثر كل هذه العوامل في تجربتك. أيضاً لابد ان تمتلك إستراتيجية في التخطيط لتجربتك!
يميل qRT-PCR إلى الحصول على العديد من التفاعلات لكل تجربة ، مما يعني الكثير من الأنابيب الصغيرة.إذا كنت لا تولي اهتمامًا وثيقًا ، فيمكنك بسهولة الخطأ وقد لا تلاحظ هذا.
يميل qRT-PCR إلى الحصول على العديد من التفاعلات لكل تجربة ، مما يعني الكثير من الأنابيب الصغيرة.إذا كنت لا تولي اهتمامًا وثيقًا ، فيمكنك بسهولة الخطأ وقد لا تلاحظ هذا.
أقوم دائمًا بتحضيرعيناتي بطريقة معينة: بالنسبة لـ cDNA ،
أقوم ب وضع عينات التحكم الخاصة " control replicates " ثم " experimental ones" .
بالنسبة إلى " primers" ، أقوم دائمًا بتجميع " housekeeping genes" في المجموعة الأولى من الأعمدة ، ثم كل " primers sets" بترتيب أبجدي.
أقوم ب وضع عينات التحكم الخاصة " control replicates " ثم " experimental ones" .
بالنسبة إلى " primers" ، أقوم دائمًا بتجميع " housekeeping genes" في المجموعة الأولى من الأعمدة ، ثم كل " primers sets" بترتيب أبجدي.
إن القيام بذلك بترتيب محدد في كل مرة (أي حسب الترتيب الأبجدي) ، يعني أنه حتى لو كنت خارج المنطقة أو أصبحت مشتتًا ، يمكنني عادةً معرفة المكان الذي كنت فيه ولا أفكر حتى في المزيج الذي أستخدمه ، لأنهم في أمر محدد مسبقا.
ارسم رسم مبسط لتجربتك قبل البدء بالعمل فهذا يساعد على التركيز
ارسم رسم مبسط لتجربتك قبل البدء بالعمل فهذا يساعد على التركيز
الكمية الأكبر هي الأفضل!
بمعنى عندما يتعلق الأمر بالمصّ ، يكون الحجم الأكبر هو الأفضل دائمًا (في حدود المعقول!). أقوم بتكوين مزيج رئيسي أقوم بتقسيمه إلى " wells " ثم أضيف مزيج cDNA المخفف (عادةً 1:20 من cDNA الأصلي). يتيح لك ذلك ماصة حجم أكبر وأن تكون أكثر دقة بقليل.
بمعنى عندما يتعلق الأمر بالمصّ ، يكون الحجم الأكبر هو الأفضل دائمًا (في حدود المعقول!). أقوم بتكوين مزيج رئيسي أقوم بتقسيمه إلى " wells " ثم أضيف مزيج cDNA المخفف (عادةً 1:20 من cDNA الأصلي). يتيح لك ذلك ماصة حجم أكبر وأن تكون أكثر دقة بقليل.
عادةً ما يكون الحجم النهائي 20 ميكرولتر ، لذا فإن المزيج الرئيسي لدي هو 11 ميكرولتر و cDNA المخفف هو 9 ميكرولتر.
تكرار ، تكرار ، تكرار لكل عينة:
حتى لو كنت خبيرًا في استخدام الماصة ، فستكون هناك اختلافات أخرى لا يمكنك التحكم فيها. سيمكنك امتلاك نسختين وثلاث مكررات تقنيًا مثاليًا لكل عينة من التعرف على ما إذا حدث شيء غريب في well واحد بحيث يمكن خصمها
حتى لو كنت خبيرًا في استخدام الماصة ، فستكون هناك اختلافات أخرى لا يمكنك التحكم فيها. سيمكنك امتلاك نسختين وثلاث مكررات تقنيًا مثاليًا لكل عينة من التعرف على ما إذا حدث شيء غريب في well واحد بحيث يمكن خصمها
لابد من ان يتم الاستغناء عن الماصة التي لم تتم معايرتها بشكل صحيح بانتظام أكثر أو أقل مما هو محدد. تقترح العديد من الشركات إعادة المعايرة كل 6-12 شهرً
اخيراً : افهم الكواشف الخاصة بك.!
غالبًا ما تحتوي SYBR-Green® والعديد من master mix على detergents مثل الجلسرين مما يجعل المحلول ثقيلاً ولابد من سحبه بالماصه بدقه وبطئ. وبالتالي ، لا يجب أن تمص هذه المحاليل اللزجة كما تفعل في الماء ، حيث إنها أكثر سمكًا بكثير .
غالبًا ما تحتوي SYBR-Green® والعديد من master mix على detergents مثل الجلسرين مما يجعل المحلول ثقيلاً ولابد من سحبه بالماصه بدقه وبطئ. وبالتالي ، لا يجب أن تمص هذه المحاليل اللزجة كما تفعل في الماء ، حيث إنها أكثر سمكًا بكثير .
Hopefully with these tips you can up your pipetting game and generate more consistent and better quality data! Keep calm and pipette on!
و عذراً على الإطالة.
و عذراً على الإطالة.
جاري تحميل الاقتراحات...