بتكلم في هذه التغريدات عن المشاكل التي من المحتمل تحدث لك اثناء العمل على PCR مما يؤدي الى عدم ظهور الباند Band،
او ظهوره بشكل مشوه،وماهي الاشياء التي من المفروض مراجعتها لمعرفة الخلل، نبدأ من الاجهزة و الكابينة(Hood)تأكد من التالي:
-تعقيم الكابينة(Hood)من الداخل قبل وضع الأدوات
او ظهوره بشكل مشوه،وماهي الاشياء التي من المفروض مراجعتها لمعرفة الخلل، نبدأ من الاجهزة و الكابينة(Hood)تأكد من التالي:
-تعقيم الكابينة(Hood)من الداخل قبل وضع الأدوات
⁃تعقيم الادوات بالكامل pipette، vortex ، microcenterfuge, box tips كل شيء سيكون داخل الكابينه hood يكون معقم، وبعد الانتهاء تشغيل UV داخل الكابينة.
⁃اذا كان هناك عامل مدرب على التنظيف والتعقيم، والا انت افعل ذلك وانا افضل ان تقوم انت بذلك.
⁃اذا كان هناك عامل مدرب على التنظيف والتعقيم، والا انت افعل ذلك وانا افضل ان تقوم انت بذلك.
⁃تأكد من عمل الاجهزة من machine PCR، centrifuge ، vortex وغيرها من الاجهزة بمعنى ممكن تكون مشكلة في التوصيل الكهربائي، والجهاز اصلا مايعمل.
⁃الادوات هل تعمل بالشكل الصحيح؟ pipette مثلا هل تسحب بالشكل الصحيح؟
اذا كان ماسبق قمت به بالشكل الصحيح
⁃الادوات هل تعمل بالشكل الصحيح؟ pipette مثلا هل تسحب بالشكل الصحيح؟
اذا كان ماسبق قمت به بالشكل الصحيح
والاجهزة تعمل ننتقل للخطوة اللي بعدها وهي تجهيز العينة:
⁃هل العينة (اذا كان عملك بحثي) المستهدفة هي صحيحة؟ هل انت من قمت باخذ العينة؟ ام العينة تم فحصها سابقا؟ اذا كانت فحصت سابقا كم المدة المحفوظة والطريقة ودرجة الحرارة؟
⁃هل العينة (اذا كان عملك بحثي) المستهدفة هي صحيحة؟ هل انت من قمت باخذ العينة؟ ام العينة تم فحصها سابقا؟ اذا كانت فحصت سابقا كم المدة المحفوظة والطريقة ودرجة الحرارة؟
هل من أُُُخُذ منه العينة مصاب بالاصل؟ (هنا الحديث عن عينة حيوانية فربما التبس عليك)هل ظهرت تغيرات على الانسجة؟
⁃نفترض اننا نتحدث عن فايروس هل الانسجة التي لديك هي مكان تضاعف الفايروس؟ الفايروس متواجد في جسم المصاب لكن هناك tropismللفايروس في عضو بالجسم، العينة مفترض ان تأخذ منه
⁃نفترض اننا نتحدث عن فايروس هل الانسجة التي لديك هي مكان تضاعف الفايروس؟ الفايروس متواجد في جسم المصاب لكن هناك tropismللفايروس في عضو بالجسم، العينة مفترض ان تأخذ منه
( المعلومة السابقة ليست قاعدة، لكل فايروس خصائصه التي من المفترض الالمام بها)
⁃تجهيز العينة وحفظها بالشكل الصحيح، عند حفظ عينة لفايروس RNA من نسيج مثلا ستكون درجة الحرارة - 80 اذا كانت لاكثر من اسبوع، وهنا جدول يوضح الوقت والاختبار لكل عينة مراد حفظها.
⁃تجهيز العينة وحفظها بالشكل الصحيح، عند حفظ عينة لفايروس RNA من نسيج مثلا ستكون درجة الحرارة - 80 اذا كانت لاكثر من اسبوع، وهنا جدول يوضح الوقت والاختبار لكل عينة مراد حفظها.
على فرضية سلامة الاجراءات السابقة ننتقل لاول خطوة لكي تحصل على نتائج من PCR وهي عملية الاستخلاص Extraction للحامض النووي:
⁃ تأكد من تاريخ kits ( في بعض الاحيان ستظهر معك نتائج حتى اذا التاريخ انتهى ومضى عليه فترة)
⁃ تأكد من تاريخ kits ( في بعض الاحيان ستظهر معك نتائج حتى اذا التاريخ انتهى ومضى عليه فترة)
⁃بعض المحاليل تحتاج الى احلال باضافة الكحول، اذا كنت اول مرة تقوم بعملية الاستخلاص من الافضل يكون شخص اخر يقوم بالعملية هذه حتى لاتخسر kit وتأكد من التالي:
⁃تأكد من الارقام التي تضعها
[µL] هذه وحدة microliter
اي بمعنى ١ milliliter يساوي ١٠٠٠ µL
⁃تأكد من الارقام التي تضعها
[µL] هذه وحدة microliter
اي بمعنى ١ milliliter يساوي ١٠٠٠ µL
وعادة في الاستخلاص تكون الارقام كبيرة من وحدة µL
⁃تأكد اثناء تعاملك مع spin column ان لاترمي الفلتر بالخطأ بعد عمل centrifuge.
الان الخطوة المهمة انك تقيس الحامض النووي بواسطة nanodrop لمعرفة تركيز الحامض النووي، هذا مؤشر انك تكمل عملك او تتوقف لترى ماهي المشكلة؟
⁃تأكد اثناء تعاملك مع spin column ان لاترمي الفلتر بالخطأ بعد عمل centrifuge.
الان الخطوة المهمة انك تقيس الحامض النووي بواسطة nanodrop لمعرفة تركيز الحامض النووي، هذا مؤشر انك تكمل عملك او تتوقف لترى ماهي المشكلة؟
الان من المفترض يكون Primer عندك جاهز، في تغريدات متحدث فيها عن البرايمر هنا تحصلها، باختصار من الافضل اذا اول مرة تتعامل ان يكون البرايمر تم تجربته سابقا.
مثال لإحلال برايمر سنجد مثلا رقم 16 od سنضيف له بعد الضرب ب 10 اي 160 µL من Nuclease-Free Water
مثال لإحلال برايمر سنجد مثلا رقم 16 od سنضيف له بعد الضرب ب 10 اي 160 µL من Nuclease-Free Water
ايضا يجب الانتباه على
Primer Melting Temperature (Tm)
وهنا سنستفيد من البرايمر اذا كان منشور او مستخدم من قبل احداً ما سابقا ان درجة الحرارة التي اظهرت الباند معروفة، هذا لايعني انك ان قمت بتصميم برايمر جديد لن تستطيع ذلك لكن الاسهل في الخيار الاول
Primer Melting Temperature (Tm)
وهنا سنستفيد من البرايمر اذا كان منشور او مستخدم من قبل احداً ما سابقا ان درجة الحرارة التي اظهرت الباند معروفة، هذا لايعني انك ان قمت بتصميم برايمر جديد لن تستطيع ذلك لكن الاسهل في الخيار الاول
على فرضية ان العينة RNA بنحتاج هنا نعمل cDNA ولنفترض ان kit هو QIAGEN® OneStep RT-PCR هنا يوجد تعليمات من المفترض انك تمشي عليها لكن بعض الاحيان( هذه ليست قاعدة) قد تستهلك نصف الكمية من الارقام المذكورة وتظهر معك نتائج الان تأكد من التالي:
- الارقام هنا تكون صغيرة بعكس الاستخلاص
- الارقام هنا تكون صغيرة بعكس الاستخلاص
هنا ملاحظة/ مثلا مادة RNAse inhibitor مكتوب عليها optional بمعنى من الممكن ان لاتضعها وتظهر معك نتائج، بمعنى اخر الكمية ستصبح اقل من ٥٠ µL هي الكمية النهائية لكل انبوب
-يجب الانتباه اثناء السحب قد لاترى الكمية في هذا الجدول نرى في الاخير الكمية لابد ان تكون µL 50( او٤٠ كما قلت)
-يجب الانتباه اثناء السحب قد لاترى الكمية في هذا الجدول نرى في الاخير الكمية لابد ان تكون µL 50( او٤٠ كما قلت)
ونرى ان بعض المواد سنقوم بالسحب منها ٢ µL فقط
-من الممكن عمل مستر ميكس كيف ذلك؟ انك تحسب عدد العينات لنفترض ١٠ وتأخذ كميه من كل انبوب لعشر عينات ثم تضعهم في eppendorf مثلا وتسحب الكمية ناقص template DNA وتضعه في كل انبوب
-من الممكن عمل مستر ميكس كيف ذلك؟ انك تحسب عدد العينات لنفترض ١٠ وتأخذ كميه من كل انبوب لعشر عينات ثم تضعهم في eppendorf مثلا وتسحب الكمية ناقص template DNA وتضعه في كل انبوب
من العشرة، وهكذا تكون الكمية متساوية من كل مادة نريد ان نسحب منها.
الان خطوة وضع العينات في الجهاز
وضبط درجة الحرارة نرجع لـ kit cDNA كما في الجدول والانتباه اثناء كتابة الارقام، من الافضل ان يساعدك مختص اذا كانت المرة
الان خطوة وضع العينات في الجهاز
وضبط درجة الحرارة نرجع لـ kit cDNA كما في الجدول والانتباه اثناء كتابة الارقام، من الافضل ان يساعدك مختص اذا كانت المرة
الاولى لك في استخدام الجهاز
الان الخطوة الاخيرة وهي وضع العينات في الجل، يجب التأكد من:
- كمية agaros powder
- طريقة اعداد TBE
-الصبغة المضافة ethidium bromide
-التيار الكهربائي وضبطه بالشكل الصحيح.
من المفترض المشاكل هنا اقل من الخطوات السابقة
معذرة على الاطالة
الان الخطوة الاخيرة وهي وضع العينات في الجل، يجب التأكد من:
- كمية agaros powder
- طريقة اعداد TBE
-الصبغة المضافة ethidium bromide
-التيار الكهربائي وضبطه بالشكل الصحيح.
من المفترض المشاكل هنا اقل من الخطوات السابقة
معذرة على الاطالة
جاري تحميل الاقتراحات...