تقنية “ western blot “ أحد التقنيات المستخدمة في لابات المناعة
- ثريد بسيط عنها
- ثريد بسيط عنها
هي تقنية تستخدم لتحديد بروتين معين من كل البروتينات الموجوده في العينة حيث يستخدم الاجسام المضادة للكشف عن البروتين عن طريق التلوين المناعي ، سميت بهذا الاسم نسبه إلى العالم الذي اكتشفها
تستخدم الاجسام المضادة ك “ props” للبروتين المراد عزله
تستخدم الاجسام المضادة ك “ props” للبروتين المراد عزله
- لها عدة خطوات وهي :
1- Sample preparation
2- Elctrophoresis “ SDS-Page “
3- Transfer
4- Blocking
5- Detection
6- analysis
1- Sample preparation
2- Elctrophoresis “ SDS-Page “
3- Transfer
4- Blocking
5- Detection
6- analysis
1- sample preparation:
يستخلص البروتين من عينات كثيره ولكن الاهم بعد الاستخلاص يُعرف تركيز البروتين في خطوه تسمى “ protein Estimation “ حتى يتم تحديد تركيز SDS-page لفصل البروتين
يستخلص البروتين من عينات كثيره ولكن الاهم بعد الاستخلاص يُعرف تركيز البروتين في خطوه تسمى “ protein Estimation “ حتى يتم تحديد تركيز SDS-page لفصل البروتين
2- SDS - Page :
اسمها العلمي هو " Sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis (SDS Page) "
وستنتقل البروتينات السالبه نحو القطب الموجب وسيتم تجزئتها حسب الوزن الجزيئي وهذه المرحله يتم فيها استخدام :
Sample , marker , stacking gel , resolving gel , running buffer
اسمها العلمي هو " Sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis (SDS Page) "
وستنتقل البروتينات السالبه نحو القطب الموجب وسيتم تجزئتها حسب الوزن الجزيئي وهذه المرحله يتم فيها استخدام :
Sample , marker , stacking gel , resolving gel , running buffer
stacking gel:
وهو الطبقه الجل في الاعلى وتحتوى على :
,Acrylamide,stacking buffer هنا يحتوي على SDS و Tris , water, Ammonium persulfate
TEMED
الكميات تختلف على حسب نسبة الجل
وهو الطبقه الجل في الاعلى وتحتوى على :
,Acrylamide,stacking buffer هنا يحتوي على SDS و Tris , water, Ammonium persulfate
TEMED
الكميات تختلف على حسب نسبة الجل
resolving gel:
وهو طبقة الجل اللي بتكون في الاسفل، تحتوى على :
Acrylamide ,Tris-Hcl ,water , SDS , Ammonium persulfate , TEMED
وعادةً ما يأخذ الرن من ٤ الى ٩ ساعات حسب الوزن الجزيئي للبروتين
و بعد تجهيز العينه يُضاف لها
وهو طبقة الجل اللي بتكون في الاسفل، تحتوى على :
Acrylamide ,Tris-Hcl ,water , SDS , Ammonium persulfate , TEMED
وعادةً ما يأخذ الرن من ٤ الى ٩ ساعات حسب الوزن الجزيئي للبروتين
و بعد تجهيز العينه يُضاف لها
Bromophenol blue
على شحنة سالبة طفيفة وسوف يهاجر بنفس اتجاه الحمض النووي ،مما يسمح بمراقبة تقدم الجزيئات التي تتحرك عبر الجل.
على شحنة سالبة طفيفة وسوف يهاجر بنفس اتجاه الحمض النووي ،مما يسمح بمراقبة تقدم الجزيئات التي تتحرك عبر الجل.
3- transfer:
تنقل البروتينات من الجل الى غشاء اكثر سماكه و يكون عباره عن " blotting peper , membrane, SDS- gel , blotting peper “ توضع في blocking buffer وتنقل ليسهل التعامل معها و حفظها و غالبا الـ membrane مصنوع من النيتروسيليوز أو الـPVDF.
تنقل البروتينات من الجل الى غشاء اكثر سماكه و يكون عباره عن " blotting peper , membrane, SDS- gel , blotting peper “ توضع في blocking buffer وتنقل ليسهل التعامل معها و حفظها و غالبا الـ membrane مصنوع من النيتروسيليوز أو الـPVDF.
4- Blocking :
ويتم في هذه الخطوه تثبيت البروتين المراد عن طريق primary antibody , secondary antibody
و يستخدم Bovine Serum Albumin المعروف بالـ BSA لتغطيه الغشاء و إلصاق البروتينات قبل اضافة الاجسام المضادة ،
ويتم في هذه الخطوه تثبيت البروتين المراد عن طريق primary antibody , secondary antibody
و يستخدم Bovine Serum Albumin المعروف بالـ BSA لتغطيه الغشاء و إلصاق البروتينات قبل اضافة الاجسام المضادة ،
الـ primary antibody يرتبط بالبروتين المراد ويعمل على تثبيته بالغشاء عندما يتم غسيل الغشاء ، وبعد الغسيل بقي البروتين الي تريد عزله و تضيف إليه secondary antibody ويعمل كـ fluorescence
و في بعض المشاكل تحدث اثناء عمل التجربة و بتكلم عن بعض الملاحظات حتى يتم تفاديها:
غالبا المشاكل تكون على النحو الاتي :
"ظهور (bands) باند غير عادية أو غير متوقعة ،لا يظهر باند ، باند باهت ضعيف، باند غير منتظم "👇🏻
غالبا المشاكل تكون على النحو الاتي :
"ظهور (bands) باند غير عادية أو غير متوقعة ،لا يظهر باند ، باند باهت ضعيف، باند غير منتظم "👇🏻
- عند إستخلاص البروتين يُنصح باستخدام protease inhibitors
- phosphatase inhibitors for phospho targets
- يُفضل أن يكن transfer buffer محضر مسبقًا ومحفوظ في مكان بارد لتفادى التحلل اثناء عمل جهاز gel electrophoresis
- phosphatase inhibitors for phospho targets
- يُفضل أن يكن transfer buffer محضر مسبقًا ومحفوظ في مكان بارد لتفادى التحلل اثناء عمل جهاز gel electrophoresis
- لحجب البروتينات الغير مرغوبة يُفضل تحضير block solution باضافة 5% من الحليب قليل الدسم في PBS مع 0.1% من tween 20 ( للتخلص من الفائض من block solution او بدلًا عن ذلك البعض يستخدم BSA
- لابد من أن تكن العينه المستخدمة جديده وذلك بسبب حساسية البروتين للعوامل الخارجية.
- لابد من أن تكن العينه المستخدمة جديده وذلك بسبب حساسية البروتين للعوامل الخارجية.
- عملية الغسيل بعد إضافه antibodies لا تقل عن ٣ مرات ولابد من إستخدام ماء معقم مفلتر
- يجب ان يكون تحضير العينة داخل ثلج لتجنب تحلل البروتين
- يجب ان يكون تحضير العينة داخل ثلج لتجنب تحلل البروتين
بإختصار 👇🏻
جاري تحميل الاقتراحات...