رتبها

ليلى

11 تغريدة 366 قراءة Oct 20, 2020

Plasmid Isolation
عملية عزل البلازميد تُعتبر من العمليات المهمة والتي تلعب دور مهم في نجاح كثير من التجارب، سواءcloning، DNA Seq ، gene therapy و غيرها.
حيث أن عملية العزل هذه تحتاج لدرجة عالية من نقاوة البلازميد المراد إستخلاصه.
:
هنا بعض النقاط المهمة في عملية عزل البلازميد

🔺بدايةً يجب أن تنمو الخلايا البكتيرية المراد منها عزل البلازميد في وسط زراعي مناسب مع {ضرورة إضافة المضاد المناسب لها } 👍🏻

🔺بعد زراعة الخلايا البكتيرية تأتي عملية الـ Centrifugationومن ثم resuspend the pelleted cells
وفي هذه الخطوة تأتي أهمية:
✔️ Tris,EDTA
وذلك لتغييرإستقرار جدار الخلية ولمنع تلف البلازميد
✔️ glycerol وذلك لمنع الخلايا من الانفجار
✔️RNase وذلك للتخلص من RNA

🔺في مرحلة lysis the cells
عن طريق إضافة alkaline solutions يحتوي على SDS و sodium hydroxide
وذلك لتسهيل تحلل الخلايا كما أنها تعمل
Denaturation for genomic and plasmid DNA along with all the proteins
🔴وهنا لابد من أن تكون خطوة cell lysis سريعة لتجنب تغيير طبيعية البلازميد 👍🏻

🔺 مرحلة إضافة potassium acetate
حيث أنه يعمل neutralize للعينة كما أنه سوف يعمل فصل للـ
Plasmid DNA from the genomic DNA
🔺مرحلة ethanol precipitated او cleaned up إما بواسطة
Phenol chloroform
أو
Filter

🛑بعض النقاط المهمة:
🔸إذا كان مطلوب عزل high yield من البلازميد الأفضل هُنا إستخدام البيئة الزراعية في مرحلة late log phase او stationery phase
والتي سبق وأن شرحتها في ثريد مسبق👍🏻

👇🏻

🔸مع الاخذ بعين الاعتبار من عدم إستخدام
Overgrow bacterial culture
لانة ممكن تؤدي إلى
gDNA contamination
👇🏻
plasmids may yield as little as
0.1ugDNA from 1ml overnight culture

🔸لابد من قياس تركيز عينة البلازميد المستخلصة عن طريق على سبيل المثال NanoDrop
🔸لابد من أخذ صورة
gel electrophoresis مع الاخذ بعين الاعتبار من إستخدام ladder المناسب، مثل supercoild DNA ladder