SDS-PAGE تقنية لفصل البروتين على أساس الوزن الجزيئي ، بينما western blot للكشف عن البروتين المهم باستخدام أجسام مضادة محددة.
هُنا راح أتكلم عن SDS-PAGE بشكل يساعد على الحصول على نتيجة ناجحة باذن الله✨👍🏻
هُنا راح أتكلم عن SDS-PAGE بشكل يساعد على الحصول على نتيجة ناجحة باذن الله✨👍🏻
بداية قد يكتفى الباحثون بعمل SDS إذا كان الغرض فقط فصل البروتينات لأغراض مثل استخلاص وتنقية البروتين وغيرها ولكن لتقنية western blot نحتاج فيها جل SDS.
أو BCA assay كحساب كمية البروتين الكلي في العينة وغيره
أو BCA assay كحساب كمية البروتين الكلي في العينة وغيره
SDS-PAGE الاسم العلمي الكامل
🔺Sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis (SDS Page)
🔺Sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis (SDS Page)
بالنسبة للبروتينات يتم استخدام (SDS) لترتيب البروتينات ونتيجة لذلك ، ستنتقل البروتينات المشحونة سلبًا نحو القطب الموجب وسيتم تجزئتها بالوزن الجزيئي أثناء gel electrophoresis و يسمى هذا الإجراء SDS-PAGE.
SDS-PAGE يحتاج:
🔺العينة المراد إستخدامها
🔺marker (gel ladder)
🔺 stacking gel
🔺 resolving gel
🔺 10x Running buffer
🔺Electrophoresis equipment (glass plates, casting stand, comb)
🔺 Sample buffer (Laemmli buffer)
🔺 10% Ammonium persulfate (APS) in water
🔺 TEMED
🔺العينة المراد إستخدامها
🔺marker (gel ladder)
🔺 stacking gel
🔺 resolving gel
🔺 10x Running buffer
🔺Electrophoresis equipment (glass plates, casting stand, comb)
🔺 Sample buffer (Laemmli buffer)
🔺 10% Ammonium persulfate (APS) in water
🔺 TEMED
🔺 بعد تجهيز العينه يُضاف لها
( Laemmli buffer) حيث يحتوي Bromophenol blue على شحنة سالبة طفيفة وسوف يهاجر بنفس اتجاه الحمض النووي ،مما يسمح بمراقبة تقدم الجزيئات التي تتحرك عبر الجل.
( Laemmli buffer) حيث يحتوي Bromophenol blue على شحنة سالبة طفيفة وسوف يهاجر بنفس اتجاه الحمض النووي ،مما يسمح بمراقبة تقدم الجزيئات التي تتحرك عبر الجل.
🔺 stacking gel
يتم استخدامه لتحسين دقة الرحلان الكهربائي بسبب تأثيره المركز على البروتينات في العينة، وهو طبقة الجل اللي بتكون في الأعلى ،تحتوى على
-Acrylamide
-stacking buffer هنا يحتوي على SDS و Tris
-water
-Ammonium persulfate
-TEMED
الكميات تختلف على حسب نسبة الجل
يتم استخدامه لتحسين دقة الرحلان الكهربائي بسبب تأثيره المركز على البروتينات في العينة، وهو طبقة الجل اللي بتكون في الأعلى ،تحتوى على
-Acrylamide
-stacking buffer هنا يحتوي على SDS و Tris
-water
-Ammonium persulfate
-TEMED
الكميات تختلف على حسب نسبة الجل
🔺 resolving gel
وهو طبقة الجل اللي بتكون في الاسفل، تحتوى على
-Acrylamide
-Tris-Hcl
-water
-SDS
-Ammonium persulfate
-TEMED
الكميات تختلف على حسب نسبة الجل المراد صنعه
وهو طبقة الجل اللي بتكون في الاسفل، تحتوى على
-Acrylamide
-Tris-Hcl
-water
-SDS
-Ammonium persulfate
-TEMED
الكميات تختلف على حسب نسبة الجل المراد صنعه
🤚🏻بين طبقتين الجل أنا شخصيًا أفضل إضافه Butanol مخفف مع الماء الملفتر بحيث يساعد على إستقرار الجل وفصله بشكل مثالي ومتساوي. لكن مهم هُنا جداً بعد تكون الجل بشكل جيد أن نغسل Butanol بالماء العادي.
🔴نحرص على إستخدام sds page pipette tips
عند وضع العينة في الجل نفس الشكل الموجود في الصوره👇🏻
عند وضع العينة في الجل نفس الشكل الموجود في الصوره👇🏻
🔴نحرص عند وضع العينة في الجل بنفس الوضعيه الموضحه في الصوره 👇🏻
🔴 بعد تشغيل الجهاز قد تستمر عملية gel electrophoresis بين ساعة وعدة ساعات حسب voltage ونسبة الجل المستخدم. البروتينات المهاجرة السريعه اللي بتكون بوزن جزيئي أقل من 5 kDa
بكذا تكون تجربة SDS-PAGE أكتملت، وممكن بعد هذه الخطوه ننتقل الى western blot👍🏻
🔺بشكل شخصي وكانصيحة دائماً أعمل ٢ جل من SDS-PAGE في نفس run واحد يبقى SDS-PAGE reference والثاني أكمل عليه خطوة western blot👍🏻✨
🔺بشكل شخصي وكانصيحة دائماً أعمل ٢ جل من SDS-PAGE في نفس run واحد يبقى SDS-PAGE reference والثاني أكمل عليه خطوة western blot👍🏻✨
لتقنية western blot
👇🏻
👇🏻
🔴خطوة مهمة بعد الانتهاء من جهاز gel electrophoresis يتم صبغ SDS gel بصبغه Coomassie blue لمساعدة ظهور الباند✨👍🏻
🔴البعض يستخدم صبغه sliver stain للبروتينات اللي تركيزها قليل
🔴عن تجربة لصبغه سريعه جداً وأكثر أمان للـ SDS gel نستخدم Instant Blue 👌🏻 هذه الصبغه تختصر كل خطوات الصبغ في خطوة واحدة فقط 👍🏻👇🏻
wolfson.huji.ac.il
wolfson.huji.ac.il
3 خطوات أساسية في تحضير SDS (protein gels) بشكل ممتع 👇🏻✨😊
:
ملاحظه: تم الاستاذن من صاحبة الفيديو لعرضه هنا✨👍🏻
:
ملاحظه: تم الاستاذن من صاحبة الفيديو لعرضه هنا✨👍🏻
💡 tips and tricks ✨
من المتعارف عليه بأن تقنية SDS-PAGE تستهلك وقت الى حين الوصول لمرحلة الحصول على النتيجة 👌🏻
لذلك هنا طريقة سريعة وبسيطة وبدون تكاليف👇🏻بحيث نستطيع تجهيز الجل في يوم منفصل وحفظه بالطريقة الظاهرة، حيث أن هذه الطريقة تساعد في المحافظة على سلامة الجل ورطوبته✨
من المتعارف عليه بأن تقنية SDS-PAGE تستهلك وقت الى حين الوصول لمرحلة الحصول على النتيجة 👌🏻
لذلك هنا طريقة سريعة وبسيطة وبدون تكاليف👇🏻بحيث نستطيع تجهيز الجل في يوم منفصل وحفظه بالطريقة الظاهرة، حيث أن هذه الطريقة تساعد في المحافظة على سلامة الجل ورطوبته✨
جاري تحميل الاقتراحات...