✨مهم بداية معرفة إختيار البلازميد الصحيح 👍🏻 والـ promoters المناسب لنوع الخلية. وبعدها تجي نقطة الجينات المقاومة في عملية اختيار البلازميد الصحيح وأيضاً بالاضافة الى إختيار بعض markers المناسبة.
🔺بعد عملية الاختيار👆🏻 تأتي أول خطوة في عملية الاستنساخ وهي عملية Digesting. لإدخال جزء DNA الخاص بك إلى plasmid، تحتاج أولاً إلى فتح الناقل الدائري لإنشاء نهايات مكملة في DNA
🔺و هنا يتم استخدام restriction enzymes
سواء لـ DNA او لـ plasmid
و الـ buffer المناسب لهذه الانزيمات
🔺و هنا يتم استخدام restriction enzymes
سواء لـ DNA او لـ plasmid
و الـ buffer المناسب لهذه الانزيمات
🔴عن تجربة 🤚🏻في عملية Digesting تأتي أهمية مدة التحضين حيث أن كل ماقل reaction unit تقل عملية التحضين
مثالاً اذا كان:
10ul reaction so no longer incubation than 1hour to avoid evaporation
مثالاً اذا كان:
10ul reaction so no longer incubation than 1hour to avoid evaporation
🔴بالاضافه إلى الاخذ بعين الاعتبار بنسبة كلاً من الحامض النووي والبلازميد المستخدمة
مثالاً على ذلك:
1-Typically 5 units of restriction enzymes used per 1ug of DNA to be digested
2- plasmid should be no more 50ug/ml to avoid contamination
مثالاً على ذلك:
1-Typically 5 units of restriction enzymes used per 1ug of DNA to be digested
2- plasmid should be no more 50ug/ml to avoid contamination
🔴أنصح بستخدام BSA كـمثبت للانزيمات المستخدمة 👆🏻
🔺تجي بعدها عملية ligation
هذه الخطوة عادة تكن عن طريق إستخدام ligase
As T4 DNA ligase
هذه الخطوة عادة تكن عن طريق إستخدام ligase
As T4 DNA ligase
🔴وهنا يجب الاخذ بعين الاعتبار بنسبة كلاً من DNA و الـ plasmid
Such as 1:1 to 1:5 Molar ratio of insert to vector
🔴بالاضافة الى الاخذ بعين الاعتبار وقت
التحضين على حسب اقتراح الشركة المستخدمه مع درجة الحرارة المناسبة
🔴ايضاً تأتي اهمية استخدام nuclease-free water
Such as 1:1 to 1:5 Molar ratio of insert to vector
🔴بالاضافة الى الاخذ بعين الاعتبار وقت
التحضين على حسب اقتراح الشركة المستخدمه مع درجة الحرارة المناسبة
🔴ايضاً تأتي اهمية استخدام nuclease-free water
🔺واخر خطوة راح تجي عملية transformation
وهذه الخطوة تجي بعد التأكد من وجود جزء DNA المدخل في plasmid بعد اختباره بواسطة gel electrophoresis لهدف الحصول على عده نسخ من 🧬DNA
واذا تأكد نجاح هذه العملية👆🏻 يتم بعدها عملية
Transform in to E.coli
وهذه الخطوة تجي بعد التأكد من وجود جزء DNA المدخل في plasmid بعد اختباره بواسطة gel electrophoresis لهدف الحصول على عده نسخ من 🧬DNA
واذا تأكد نجاح هذه العملية👆🏻 يتم بعدها عملية
Transform in to E.coli
🔴 تلعب في هذه الخطوة أهمية إختيار competent cells المناسبة مثال
-dh5a competent cells
-Bl21 competent cells
-dh5a competent cells
-Bl21 competent cells
أخيراً ماننسى أهمية عمل مخزون من الخلايا ( transformed cells) في 50% من glycerol 😅 وتخزينها في -80°👍🏻
جاري تحميل الاقتراحات...