معلومات مختصرة عن جهاز PCR
تقنية مخبريه تم اكتشافها عام 1983م تقريباً من قبل العالم، Kary Mullins كما حصل على جائزة نوبل 1993 ، لها استخدامات متعددة أهمها الكشف عن #فايرس_كورونا يوجد منها أنواع المصطلحات لكل نوع ووظائفهم الأساسية 👇🏻
1️⃣ PCR
2️⃣ qPCR
3️⃣ RT-PCR
4️⃣ RT-qPCR
تقنية مخبريه تم اكتشافها عام 1983م تقريباً من قبل العالم، Kary Mullins كما حصل على جائزة نوبل 1993 ، لها استخدامات متعددة أهمها الكشف عن #فايرس_كورونا يوجد منها أنواع المصطلحات لكل نوع ووظائفهم الأساسية 👇🏻
1️⃣ PCR
2️⃣ qPCR
3️⃣ RT-PCR
4️⃣ RT-qPCR
Let us not be confused with:
- polymers chain Reaction ( PCR)
- Real-Time (quantitative) PCR (qPCR)
- Reverse Transcription PCR (RT-PCR), and
- Real-Time Reverse Transcription PCR (qRT-PCR or RT-qPCR).
- polymers chain Reaction ( PCR)
- Real-Time (quantitative) PCR (qPCR)
- Reverse Transcription PCR (RT-PCR), and
- Real-Time Reverse Transcription PCR (qRT-PCR or RT-qPCR).
Function:
PCR function is to make copies of DNA.
qPCR measures the content of mRNA in sample.
RT pcr. It make copies of DNA from mRNA called CDNA by the help of enzyme reverse transcriptase.
PCR function is to make copies of DNA.
qPCR measures the content of mRNA in sample.
RT pcr. It make copies of DNA from mRNA called CDNA by the help of enzyme reverse transcriptase.
تقوم على إكثار نسخ الحمض النووي (DNA ) خارج النظام الحيوي . أي أنها طريقة لنسخ الحمض النووي في المختبر. و لذلك فهي تقنية حيوية لاستنساخ قطعة من محددة من الحمض النووي و مضاعفة إنتاجها لكي يتسنى إجرى عليه اختبارات و فحوصات إضافية.
Polymerase Chain Reaction (PCR)
تهدف تقنية PCR إلى تضخيم جزيئات قليلة من الحمض النووي DNA، بعد استخلاصه من خلايا أو سوائل الجسم وبالتالي الحصول على كميات كبيرة منه يمكن إجراء التحليل عليه. يمكن اعتبار تقنية PCR ترجمة مبسطة لعملية انتساخ الحمض النووي DNA
تهدف تقنية PCR إلى تضخيم جزيئات قليلة من الحمض النووي DNA، بعد استخلاصه من خلايا أو سوائل الجسم وبالتالي الحصول على كميات كبيرة منه يمكن إجراء التحليل عليه. يمكن اعتبار تقنية PCR ترجمة مبسطة لعملية انتساخ الحمض النووي DNA
ولكي يتم هذا الانتساخ، لا بد من توفر مواد معينة تساعد على ذلك:
.1 البادئات Primers وهي عبارة عن نيوكلوتيدات قليلة Oligonucleotides (18 – 20 أساس آزوتي) قادرة على الارتباط مع الأسس الآزوتية للحمض النووي المراد تضخيمه،
.1 البادئات Primers وهي عبارة عن نيوكلوتيدات قليلة Oligonucleotides (18 – 20 أساس آزوتي) قادرة على الارتباط مع الأسس الآزوتية للحمض النووي المراد تضخيمه،
وذلك في منطقة ذات ترتيب مميز ونوعي غير متبدل للأسس الازوتية في الحمض النووي أو ما يعرف بمنطقة عالية الحفظ Highly Conserved Region
2 كميات وافرة من النيوكليوزيدات ثلاثية الفوسفات منقوصة الأوكسجين
(dATP,dCTP,dGTP,dTTP)Deoxynuleoside triphosphates(dNTPs)
2 كميات وافرة من النيوكليوزيدات ثلاثية الفوسفات منقوصة الأوكسجين
(dATP,dCTP,dGTP,dTTP)Deoxynuleoside triphosphates(dNTPs)
3 أنظم البوليميراز Polymerase مقاوم للحرارة المرتفعة، وأهمها Taq Polymerase المستخلص من بكتيريا تعيش في الينابيع الحارةThermus aquaticus
4 محاليل واقيه Buffers
4 محاليل واقيه Buffers
5 شوارد مناسبة، أهمها شاردة المغنيزيوم Mg+2 التي تعتبر عامل متمم Cofactor لأنظيم البوليمراز
تتألف تقنية PCR من ثلاث مراحل في دورة واحدة
مرحلة التمسخ الحراري Thermal denaturation لجزيءDNA الهدف فصل الطاق المزدوج ds-DNA إلى طاقين منفصلين ss-DNA وتتم هذه المرحلة عند درجة حرارة 94 م
تتألف تقنية PCR من ثلاث مراحل في دورة واحدة
مرحلة التمسخ الحراري Thermal denaturation لجزيءDNA الهدف فصل الطاق المزدوج ds-DNA إلى طاقين منفصلين ss-DNA وتتم هذه المرحلة عند درجة حرارة 94 م
مرحلة تشفع البادئات Primers annealing، أي ارتباط كلا البادئتين مع الطاقين المنفصلين عند درجة حرارة 55م
تطاول البادئات المتشفعة Annealed primers extension بمساعدة أنظم البوليمراز وذلك بإضافة dNTPs ابتداء من البادئة وفي الاتجاه 3← 5، وتتم هذه المرحلة عند درجة حرارة 72 م.
تعاد هذه الدورة ذات الخطوات الثلاثة عدداً من المرات، مما يؤدي إلى زيادة جزيئات DNA بشكل أسي.
تعاد هذه الدورة ذات الخطوات الثلاثة عدداً من المرات، مما يؤدي إلى زيادة جزيئات DNA بشكل أسي.
ويعطى عامل التضخيم بالمعادلة التالية = n ( 1+E )x ، حيثn = الكمية البدئية للحمض النووي الهدف
E = فعالية التضخيم ( (Efficiency
X = عدد دورات PCR
E = فعالية التضخيم ( (Efficiency
X = عدد دورات PCR
تقنية RT-PCR 👇🏻
يمكن تطبيق تقنية PCR على الحمض النوويRNA بإجراء خطوه أولية وهي تكوين نسخة متممة من
ComplementaryDNA(cDNA)DNA
بواسطه انظيم الترنسكريتباز العكوسreverse tran******ase، ليخضعcDNA بعدها لمراحل التتضخيم السابقة.
وتعرف هذه التقنيةRT-PCR
يمكن تطبيق تقنية PCR على الحمض النوويRNA بإجراء خطوه أولية وهي تكوين نسخة متممة من
ComplementaryDNA(cDNA)DNA
بواسطه انظيم الترنسكريتباز العكوسreverse tran******ase، ليخضعcDNA بعدها لمراحل التتضخيم السابقة.
وتعرف هذه التقنيةRT-PCR
إن الحساسية العالية التي تبديها تقنية PCR، تجعلها عرضة لإعطاء نتائج إيجابية كاذبة بسبب تلوث خارجي المنشأ Contamination Exogenous. أهم مصادر هذا التلوث :
1 التلوث بمنتجات تضخيم سابقة Carryover contamination
2 التلوث من عينة أخرى Sample to sample contamination
1 التلوث بمنتجات تضخيم سابقة Carryover contamination
2 التلوث من عينة أخرى Sample to sample contamination
لذا يعتبر التلوث العقبة الوحيدة المهمة التي تواجه استخدام تقنية PCR لغايات تشخيصية. يمكن تجنب التلوث بالانتباه لتفاصيل العمل المخبري بتقنيةPCR .لذلك تم الاعتماد على تقسيم مكان العمل إلى ثلاثة أقسام منفصلة عن بعضها بشكل تام:
1 قسم Extraction sector
2 قسم تحضير الكواشفReagent preparation sector) وهذان القسمان يعرفان بــــPre – PCR sector)
3 قسم التضخيم والمعايرة
Amplification + Detection sector
2 قسم تحضير الكواشفReagent preparation sector) وهذان القسمان يعرفان بــــPre – PCR sector)
3 قسم التضخيم والمعايرة
Amplification + Detection sector
التطبيقات السريرية لتقنية PCR
1 الكشف المباشر للجراثيم – الفيروسات – الطفيليات)
2 تحديد الحمل الفيروسي Viral Load وتحديد
3 تحديد الأنماط الجينية Genotyping للفيروس الكبدي C
5 الأمراض الوراثية
6 تشخيص الأمراض السرطانية
8 تلعب تقنية PCR دوراً هاماً في الطب الجنائي والشرعي.
1 الكشف المباشر للجراثيم – الفيروسات – الطفيليات)
2 تحديد الحمل الفيروسي Viral Load وتحديد
3 تحديد الأنماط الجينية Genotyping للفيروس الكبدي C
5 الأمراض الوراثية
6 تشخيص الأمراض السرطانية
8 تلعب تقنية PCR دوراً هاماً في الطب الجنائي والشرعي.
أخيراً وليس أخرا، كانت تقنية PCR تستخدم في تسعينيات القرن الماضي كاختبارات استقصائية متممة، ولكن في نهاية القرن العشرين بدأت هذه التقنية تحل محل تقنيات كثيرة أخرى لأنها أثبتت فعالية كبيرة ودقة ممتازة.
وفي مطلع القرن الواحد والعشرين وبعد إتمام سلسلة الجينوم البشري، أصبح ينظر إلى كامل هذا القرن بأنه قرن الجينوميات Genomics وسيكون لتقنيةPCR دوراً أساسياً في هذه الثورة العلمية الكبرى
ما هي متطلباتPCR :
1 جهاز للتحكم بدرجات حرارة ( Thermocycle )
2 البليمريز وهو الإنزيم الذي يقوم ببناء وترتيب القواعد النيتروجينية ( حدات الحمض النووي (DNA ) ) ، ويجب أن يكون هذا الإنزيم مقاوم للحرارة العالية ليتمكن من العمل . و قد اكتشف انزيم مقاوم للحرارة و اسم تاج Tag
1 جهاز للتحكم بدرجات حرارة ( Thermocycle )
2 البليمريز وهو الإنزيم الذي يقوم ببناء وترتيب القواعد النيتروجينية ( حدات الحمض النووي (DNA ) ) ، ويجب أن يكون هذا الإنزيم مقاوم للحرارة العالية ليتمكن من العمل . و قد اكتشف انزيم مقاوم للحرارة و اسم تاج Tag
3 مجموعة متفرقة من القواعد النيتروجينية ( A T C G ) ليتمكن الإنزيم من ترتيبها في مواقعها أثناء عملية نسخ الحمض النووي (DNA )
4 بريمر Primer وهو قطعة صغيرة من الحمض النووي (DNA ) ليتمكن الإنزيم من بداء البناء و النسخ
5 والشيء الأهم هو وجود نسخة من الحمض النووي (DNA ) المراد نسخه
4 بريمر Primer وهو قطعة صغيرة من الحمض النووي (DNA ) ليتمكن الإنزيم من بداء البناء و النسخ
5 والشيء الأهم هو وجود نسخة من الحمض النووي (DNA ) المراد نسخه
6. بالإضافة إلى محلول أو وسط ليتم به التفاعل : وهذا المحلول يختلف بين تفاعل و أخر ،
لتقنية PCR تطبيقات كثيرة في مجال أبحاث الحمض النووي (DNA ) و الوراثة ومنها :
1. الكشف عن الطفرات الوراثية : وذلك عن طريق وضع بريمر خاص للطفرة لتكثير الجين الخاص بها . ومنه نقوم بمعرفة المرض إذا كان على زوجين الكروموسومات أو على احدهما ( allele )
2. تعين البصمة الوراثية .
1. الكشف عن الطفرات الوراثية : وذلك عن طريق وضع بريمر خاص للطفرة لتكثير الجين الخاص بها . ومنه نقوم بمعرفة المرض إذا كان على زوجين الكروموسومات أو على احدهما ( allele )
2. تعين البصمة الوراثية .
3. الكشف عن الفيروسات : وهذه الطريق هي الأدق في تحديد نوع وجنس الفيروس وكميته.
4. هو العنصر الأهم في عملية التجميع الجيني ( Recombinant الحمض النووي (DNA ) حيث نقوم بتكثير الجين المراد إدخاله على البلازمد أو الحمض النووي (DNA ) المضيف .
4. هو العنصر الأهم في عملية التجميع الجيني ( Recombinant الحمض النووي (DNA ) حيث نقوم بتكثير الجين المراد إدخاله على البلازمد أو الحمض النووي (DNA ) المضيف .
5 هو العملية الأساس في تحديد تتابع القواعد النيتروجينية في الحمض النووي (DNA ) ( الحمض النووي (DNA ) Sequencer )
6 معرفة طول الحمض النووي (DNA )
7 في مشروع الخارطة الجينية البشرية (human genome project )
8 في مجال الطب الشرعي ( اختبار الأمومة ، حالات الاغتصاب ، تحديد الهوية الخ
6 معرفة طول الحمض النووي (DNA )
7 في مشروع الخارطة الجينية البشرية (human genome project )
8 في مجال الطب الشرعي ( اختبار الأمومة ، حالات الاغتصاب ، تحديد الهوية الخ
rtPCR 👇🏻
وهو اختصار لـ ( Real Time PCR ) وهذا النوع يقوم على نفس المبدأ ولكن الخلاف الوحيد يكون مربتط الجهاز بكمبيوتر لتحديد الوقت الحقيقي لبدا التفاعل ومن ثم الكمية الحقيقية لعدد نسخ الحمض النووي (DNA ) ويعتمد ذلك على وجود قواعد نيتروجينية .
وهو اختصار لـ ( Real Time PCR ) وهذا النوع يقوم على نفس المبدأ ولكن الخلاف الوحيد يكون مربتط الجهاز بكمبيوتر لتحديد الوقت الحقيقي لبدا التفاعل ومن ثم الكمية الحقيقية لعدد نسخ الحمض النووي (DNA ) ويعتمد ذلك على وجود قواعد نيتروجينية .
حرة مشعة لتحديد ذلك ، مما يسهل على الباحثين الوقت لتحدد وجود الجين المطلوب أو لا ، وكمية الجين بدون الوصول إلى نهاية الدورات الحرارية .
جاري تحميل الاقتراحات...