1️⃣
#ثريد عن Gel Electrophoresis
كثير نسمع عن هذه التقنية وهي جدا مهمة في الكيمياء الحيوية والسريرية والبيولوجي الجزئية وعلم الوراثة والفيروسات وغيرهــا لفصل وتنقية الجزيئات الكبيرة وخصوصًا البروتين الأحماض النووية . تستخدم عادة بعد PCR و Cloning الغرض من الترحيل هو فصل الدنا .
#ثريد عن Gel Electrophoresis
كثير نسمع عن هذه التقنية وهي جدا مهمة في الكيمياء الحيوية والسريرية والبيولوجي الجزئية وعلم الوراثة والفيروسات وغيرهــا لفصل وتنقية الجزيئات الكبيرة وخصوصًا البروتين الأحماض النووية . تستخدم عادة بعد PCR و Cloning الغرض من الترحيل هو فصل الدنا .
2️⃣
الغرض من الترحيل هو فصل الدنا
كيف يتم الفصل : يتم الفصل في وسط داعم( الجل) مثل الاغاروز أو البولي اكرمايد ..
الاغاروز هو الوسط الأكثر شعبية لفصل الأحماض النووية الوسط والكبيرة الحجم .. ماهو الاغاروز ! هو بوليمر طبيعي من الأعشاب البحرية التي تشكل مصفوفه هلامية
الغرض من الترحيل هو فصل الدنا
كيف يتم الفصل : يتم الفصل في وسط داعم( الجل) مثل الاغاروز أو البولي اكرمايد ..
الاغاروز هو الوسط الأكثر شعبية لفصل الأحماض النووية الوسط والكبيرة الحجم .. ماهو الاغاروز ! هو بوليمر طبيعي من الأعشاب البحرية التي تشكل مصفوفه هلامية
3️⃣
بواسطة رابطة الهيدروجين عند تسخينها في بفر ثم تبريده . ملاحظة : ميزة الاغاروز سهل وسريع التحضر وسهولة سكبه ولا يفسد العينة، ويمكن استرداد العينة بعد سكبها عليه . ملاحظة : تركيز الاكاروز 0.8 % يستخدم لفصل جزيئات الدنا الكبيرة وتركيز الاكاروز 2 % للجزيئات الصغيرة ..
بواسطة رابطة الهيدروجين عند تسخينها في بفر ثم تبريده . ملاحظة : ميزة الاغاروز سهل وسريع التحضر وسهولة سكبه ولا يفسد العينة، ويمكن استرداد العينة بعد سكبها عليه . ملاحظة : تركيز الاكاروز 0.8 % يستخدم لفصل جزيئات الدنا الكبيرة وتركيز الاكاروز 2 % للجزيئات الصغيرة ..
4️⃣
يعتمد الفصل على:
1. الشحنة charge (فيما إذا لو كانت سالبة أو موجبة)
2. حجمها أو وزنها الجزيئي formula weight (فالجزيئات الصغيرة تتحرك خلال الهلام بصورة أسرع من الجزيئات الكبيرة)
3. حجم الثقوب pore size (كلما كان حجم الثقوب صغيرا كلما كان ذلك ملائما لفصل الجزيئات الصغيرة والعكس
يعتمد الفصل على:
1. الشحنة charge (فيما إذا لو كانت سالبة أو موجبة)
2. حجمها أو وزنها الجزيئي formula weight (فالجزيئات الصغيرة تتحرك خلال الهلام بصورة أسرع من الجزيئات الكبيرة)
3. حجم الثقوب pore size (كلما كان حجم الثقوب صغيرا كلما كان ذلك ملائما لفصل الجزيئات الصغيرة والعكس
5️⃣
4. قوة التيار الكهربائي the strength of the electrical field (يستخدم التيار الكهربائي العالي للفصل السريع للجزيئات الصغيرة بشكل عام ولكن على أن لا يكون عالي جدا لأن هذا يؤدي إلى تحطم الجزيئات عند تعرضها إليه.
4. قوة التيار الكهربائي the strength of the electrical field (يستخدم التيار الكهربائي العالي للفصل السريع للجزيئات الصغيرة بشكل عام ولكن على أن لا يكون عالي جدا لأن هذا يؤدي إلى تحطم الجزيئات عند تعرضها إليه.
6️⃣
أما التيار الواطيء فيستخدم عادة لفصل الجزيئات الكبيرة التي تتشوه عند الارتفاع البسيط لقوة التيار, ولكن على أن لا يكون التيار واطيء جدا لأنه كلما كان التيار واطئا كان وقت الترحيل كبيرا
أما التيار الواطيء فيستخدم عادة لفصل الجزيئات الكبيرة التي تتشوه عند الارتفاع البسيط لقوة التيار, ولكن على أن لا يكون التيار واطيء جدا لأنه كلما كان التيار واطئا كان وقت الترحيل كبيرا
7️⃣
المعدات اللازمة للترحيل :
1_ غرفة الترحيل وامداد الطاقة
2_ صواني صب الجل، تتكون من بلاستيك شفاف بأحجام متنوعة.
3_ مشط العينة، يصب حوله الجل لتكوين حفر العينة(wells)
4_ بفر الترحيل (TAE, TBE) يساعد ع نقل التيار الكهربائي بين القطب السالب و القطب الموجب.
المعدات اللازمة للترحيل :
1_ غرفة الترحيل وامداد الطاقة
2_ صواني صب الجل، تتكون من بلاستيك شفاف بأحجام متنوعة.
3_ مشط العينة، يصب حوله الجل لتكوين حفر العينة(wells)
4_ بفر الترحيل (TAE, TBE) يساعد ع نقل التيار الكهربائي بين القطب السالب و القطب الموجب.
8️⃣
5_بفر التحميل مثل الجلسرين، للسماح للعينة للسقوط في بئر العينة، واصباغ التتبع التي تسمح للمراقبة البصرية ومدى تقدم الترحيل
6_الصبغة (بروميد الاثيديوم) بوجود الضوء فوق البنفسجي تمكننا الصبغة من رؤية حزم جزيئات الدنا
7_ صندوق الضوء فوق البنفسجي لرؤية جزيئات الدنا الصبغة في الجل
5_بفر التحميل مثل الجلسرين، للسماح للعينة للسقوط في بئر العينة، واصباغ التتبع التي تسمح للمراقبة البصرية ومدى تقدم الترحيل
6_الصبغة (بروميد الاثيديوم) بوجود الضوء فوق البنفسجي تمكننا الصبغة من رؤية حزم جزيئات الدنا
7_ صندوق الضوء فوق البنفسجي لرؤية جزيئات الدنا الصبغة في الجل
9️⃣
خطوات الترحيل :
1_ خليط الجل (0.8% من الاكاروز) مع 100ml TBE
نتركه للغليان
2_ بعدها نتركه حتى يبرد ٦٠ْ
3_ بعدها نضيف الاثيديوم برومايد
ملاحظة : يجب التعامل مع هذه الصبغة بحذر لأنها صبغه مسرطنة..
خطوات الترحيل :
1_ خليط الجل (0.8% من الاكاروز) مع 100ml TBE
نتركه للغليان
2_ بعدها نتركه حتى يبرد ٦٠ْ
3_ بعدها نضيف الاثيديوم برومايد
ملاحظة : يجب التعامل مع هذه الصبغة بحذر لأنها صبغه مسرطنة..
1️⃣0️⃣
ملاحظة: عند إضافة صبغة بروميد الاثيديوم إلى هلام الأكاروز قبل تصلبه، فان هذا له فائدة ومضرة، أما الفائدة هي قدرة الباحث في تعقب عينة الـ DNA نفسها في أي وقت من أوقات الترحيل الكهربائي ، أما المضرة ، فتتمثل من احتمال تشوه عينات الـ DNA بسبب تداخل هذه الصبغة في جزيئات الـ DNA
ملاحظة: عند إضافة صبغة بروميد الاثيديوم إلى هلام الأكاروز قبل تصلبه، فان هذا له فائدة ومضرة، أما الفائدة هي قدرة الباحث في تعقب عينة الـ DNA نفسها في أي وقت من أوقات الترحيل الكهربائي ، أما المضرة ، فتتمثل من احتمال تشوه عينات الـ DNA بسبب تداخل هذه الصبغة في جزيئات الـ DNA
1️⃣1️⃣
وهذا يفقد جزيئات الـ DNA فعاليتها البايولوجية.
4_ بعدها نصب الخليط بالجل راك ونضيف المشط لتكوين حفر العينة..
ملاحظة : يوضع المشط بارتفاع 0.5 – 1.0 mm فوق وعاء صب الهلام لكي تتكون حفرة كاملة عند إضافة الأكاروز. وإذا كان المشط أقرب إلى صفيحة وعاء صب الهلام ،
وهذا يفقد جزيئات الـ DNA فعاليتها البايولوجية.
4_ بعدها نصب الخليط بالجل راك ونضيف المشط لتكوين حفر العينة..
ملاحظة : يوضع المشط بارتفاع 0.5 – 1.0 mm فوق وعاء صب الهلام لكي تتكون حفرة كاملة عند إضافة الأكاروز. وإذا كان المشط أقرب إلى صفيحة وعاء صب الهلام ،
1️⃣2️⃣
فان هنالك خطر يتمثل بتمزق قاعدة الحفرة
عندما يسحب المشط, وهذا بدوره يسمح للعينة بأن تتسرب مابين الهلام والصفيحة.
5_نتركه يبرد حتى التصلب ثم نرفع المشط
6_ تخلط العينات (عينات الـ DNA) مع بفر التحميل loading buffer. وباستخدام micropipette مناسب ،
فان هنالك خطر يتمثل بتمزق قاعدة الحفرة
عندما يسحب المشط, وهذا بدوره يسمح للعينة بأن تتسرب مابين الهلام والصفيحة.
5_نتركه يبرد حتى التصلب ثم نرفع المشط
6_ تخلط العينات (عينات الـ DNA) مع بفر التحميل loading buffer. وباستخدام micropipette مناسب ،
1️⃣3️⃣
توضع العينات الممزوجة مع بفر التحميل في حفر العينات, ويوضع الوعاء في غرفة الترحيل الكهربائي.
مع ترك حفرة يوضع فيها ladder الذي يكون معلوم الحزم..
ونبدأ الترحيل سوف تتحرك جزيئات الدنا باتجاه الشحنه الموجبة ..
توضع العينات الممزوجة مع بفر التحميل في حفر العينات, ويوضع الوعاء في غرفة الترحيل الكهربائي.
مع ترك حفرة يوضع فيها ladder الذي يكون معلوم الحزم..
ونبدأ الترحيل سوف تتحرك جزيئات الدنا باتجاه الشحنه الموجبة ..
1️⃣4️⃣
بعدها نضع صبغة الاثيديوم للجل مرة أخرى..
بعدها نضع الجل تحت الأشعة فوق البنفسجية.. ونرى الحزم .. ملاحظة 🛑 عند استخدام هذه الصبغة يجب ارتداء قلفز والانتباه والحذر لانها مادة مسرطنة.
بعدها نضع صبغة الاثيديوم للجل مرة أخرى..
بعدها نضع الجل تحت الأشعة فوق البنفسجية.. ونرى الحزم .. ملاحظة 🛑 عند استخدام هذه الصبغة يجب ارتداء قلفز والانتباه والحذر لانها مادة مسرطنة.
@DalalAl7arbi العفو الله يجزاك خير دكتوره دلال ووفقنا الله وياكم .
جاري تحميل الاقتراحات...