رتبها

اهلاً بالجميع 🌹
الطلاب المقبلين على فترة الامتياز ، هذا الثريد يهمكم راح اتكلم عن وحده من أهم التقنيات المستخدمة في Virology Lab وهي
( Enzyme-linked immunosorbent assay ) ELISA
يكون الهدف منه الكشف عن وجود Antibodies أو Antigen

في تقنية Elisa غالباً يكون Antigen مصنع وموضوع على طبق بلاستيك Micro titter أو Micro plate
Well-96 Or 384-well
polystyprene plate
تحتوي على ١٢ عمود مرقمه من ١-١٢
وعلى ٨ صفوف مرقمه من A-H

ضروري تعرفون أن ELISA أربع أنواع
- Direct ELISA
- Indirect ELISA
- Sandwich ELISA
- Competitive ELISA
والاكثر شهرة واستخدام هي indirect
* نوع العينه غالباً serum لأنه غني ب Antibody
هذي صور توضح الفرق بين Direct and indirect ELISA

2- Antigen وهو الجسم الغريب اللي دخل لجسم الانسان وحفزه انه ينتج ضده Antibody
3- Antibodies ( IgG , IgM , IgE , IgA , IgD)
ملاحظه مهمه لازم تكونون فاهمين ان أول مايدخل المايكروب (antigen) الجسم يفرز نوعينAB نوع IgG and IgM الفرق بينهم إن IgM يخف وجوده في الدم بعد فتره بينما

IgG يبقى فتره طويله جداً حتى بعد الشفاء من الاصابه
4- Micropippite
5- ELISA KIT
Conjugate -6
وهي عباره عن Second Antibody مرتبط بإنزيم
ياما يكون
Enzyme - Horseradish peroxidase
Or Alkaline phosphatase
7- Substrate ماده ترتبط ب conjugate وتظهر لون
8- Washer
9- Reader

Indirect ELISA
( تتعرف على وجود Antibodies )في سيروم المريض.
بما اننا نبحث عن Antibody هذا معناه ان Antigen
بيكون جاهز ومصنع وموضوع على well اللي بيحدث فيها التفاعل
نضيف عليه Serum المريض
اذا كان السيرم يحتوي على Antibody المخصصه لهذا الانيجين راح يصير تفاعل

ويرتبطون مع بعض بس ارتباط غير مرئي عشان نشوف هذا التفاعل لابد نظيف(Conjugate (Anti-Human IgG وهي عباره عن antibody مرتبط بإنزيم مخصص فقط للإرتباط ب Antibody المرتبط ب Antigen بعد كذا نضيف Substrate عشان ترتبط ب conjugate
راح يظهر لون يقرأه جهاز Reader.

النتيجه يا تكون
Qualitative-
Positive or negative
Quantitative-
( concentration تعطيك نسبة التركيز الأجسام المضادة )
فيكون رقم وانت تقارنه بالرقم المعطى من الجهاز اذا اكثر منه فمعناه الإصابة موجودة.

بالنسبة للفرق بين Direct and indirect ELISA
هو ان Direct يكون ارتباط Antibody Conjugate بشكل مباشر في Antigen
بينما indirect يرتبط Conjugate في Antibody المرتبط في Antigen يعني يكون عندي اثنين Antibodies واحد من السيرم و الثاني تبع Conjugate 🌝

Indirect ELISA
دايم نبحث عن Antigen في العينه
النتيجه يا تكون + او - على حسب وجود antigens في سيرم المريض

Sandwich ELISA
تبحث عن وجود Antigens في السيرم
*مثال مبسط على تقنية الساندويش هي اختبارات الحمل المنزلية.
سميت بالساندوش لان Antigen بيكون موجود وسط اثنين Antibodies كذا زي شكل الساندويش

طبعاً بيكون Antibody Specific للانتجين الي نبحث عنه وبيكون جاهز ومصنع وموضوع على طبق Micro titter لما نحط السيرم راح يرتبط الانتيجين في AB بعدها نضيف Enzyme -Antibody الي راح يرتبط بنفس الانتيجين وهنا يكون شكلها زي الساندويش 🥪 بعدين تنضاف Substrate الي راح تعطينا لون

Competitive ELISA
هنا لازم نركز انه هذي التقنيه تعتمد على Concentrations يعني ماراح تعطيني + و - لا راح تعطيني كمية Antigens or Antibodies الي تدور عليهم.
حطيت لكم صورة توضح الفرق بينها وبين باقي انواع ELISA

راح اشرح لكم بمثال عشان توضح الصوره اكثر ، لو مثلاً انا راح ابحث عن Antigen مثلا HCV,راح أخذ السير م وأسوي له Mix مع Reagent مصنعه تحتوي علىAntigens HCV. ومن هنا جت التسمية لان الانتيجينات المصنعة واللي في السيروم راح يتنافسون من يرتبط اسرع في Antibody الموجود على

Microtitter plate well
ولازم نركز أننا احنا نبغى Antigen معين وما اعرف كم Antigen في سيروم عندي, عشان كذا well نفسها محطوط عليها مادة تسوي Block لكل الانتيجين فما في مكان للارتباط الا عن طريق Antibody المخصص للارتباط ب Antigen معين وعندنا هنا HCV

بعد ما تحط Antigen Mixture على well راح يصير التفاعل وتتنافس الانتجينات على الارتباط ب Antibody.
إذا كانت Antigens موجوده راح ترتبط اكثر من المصنعة واذا ماكانت موجوده او موجوده بكمية قليله الانتيجينات المصنعة راح تطغى
عشان نقرا النتيجه راح نضيف Substrate وبعدها نضيف

Stop solutions عشان يرتبط ب الانتيجينات المصنعة ويعطينا لون اصفر ومن هنا نقدر نعرف انه كل مازال عندي تركيز اللون الاصفر في Well معناته ان Antigens في السيرم اقل وفي جهاز يقرا لنا النتيجه بشكل دقيق
وهنا فديو يشرح لكم الطريقه بشكل مفصل ومختصر
youtu.be

وهنا جبت لكم اهم الاجهزه الي راح تواجهكم في فترة الامتياز وتستخدم تقنية ELISA
1- Eti-Max 3000 وهو يعتبر Fully automated يعني يقدر يسوي كلprocessing راح (يسوي تخفيف للعينه،راح يضيف العينه على plate,راح يسوي incubation ، و washing،ويقرا التفاعل ويطلع النتيجة)
هذي صورة الجهاز 👇🏽